圖1 ChtBD bFGF（ChiBD bFGF）綁定幾丁質(zhì)膜用于傷口愈合的示意圖。ChtBD-bFGF能夠主動(dòng)識(shí)別并結(jié)合幾丁質(zhì)的傷口敷料，發(fā)揮長(zhǎng)效緩釋作用，促進(jìn)植入部位的細(xì)胞化和血管化《1［1］。

       bFGF是一種有絲分裂原，是成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子。在創(chuàng)傷部位，血小板釋放的bFGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成。這種效應(yīng)對(duì)組織生長(zhǎng)和組織重塑很重要（Barrientos、Stojadinovic、Golinko、Brem和Tomic Canic，2008）。bFGF的直接應(yīng)用并不能加速傷口愈合，因?yàn)樵趥诓课?/span>bFGF會(huì)迅速?zèng)_洗丟失或被傷口敷料吸收（Richard等人，1995年）。不適當(dāng)?shù)膫诜罅蠒?huì)在4小時(shí)內(nèi)使bFGF濃度降低50%（Finetti&Farina，1992）。

甲殼素/殼聚糖是一種天然衍生聚合物，具有生物可降解、生物相容性、無(wú)毒、抗菌、水合等優(yōu)點(diǎn)。近幾十年來(lái)，這些特性使得殼聚糖能夠被加工成許多傷口敷料（Abdel Mohsen等人，2016；Archana，Dutta和Dutta，2016）。幾丁質(zhì)膜已用于修復(fù)大鼠傷口模型，顯示出加速傷口愈合的能力（Yusof、Wee、Lim和Khor，2003）。利用殼聚糖創(chuàng)面敷料能穩(wěn)定控制生長(zhǎng)因子的釋放。Nimura等將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）加入殼聚糖溶液中，通過(guò)冷凍干燥制備不同濃度的bFGF-殼聚糖膜。傷口愈合結(jié)果表明，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-殼聚糖膜是一種穩(wěn)定的促進(jìn)傷口愈合的載體（Mizuno等人，2003年）。然而，生長(zhǎng)因子在體內(nèi)是不穩(wěn)定和擴(kuò)散性的，容易丟失或失活。

為實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子在體內(nèi)更加安全長(zhǎng)效的作用，以及更便捷穩(wěn)定地與材料相結(jié)合，中科院長(zhǎng)春應(yīng)化所團(tuán)隊(duì)利用現(xiàn)代合成生物學(xué)技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種與幾丁質(zhì)/殼聚糖具有高親和力的新型bFGF（ChtBD-bFGF）。該新型因子是在bFGF中引入了幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChtBD），而該結(jié)構(gòu)域來(lái)源于循環(huán)芽孢桿菌WL-12幾丁質(zhì)酶A1（ChiA1），54個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖2和圖3）。

Fig. 3. SDS-PAGEand western blotting of ChtBD-bFGF and bFGF fusion protein. (A) SDS-PAGEanalysis of purified fusion proteins. M, protein marker; lanes 1–2, purified ChtBD-bFGF,and bFGF proteins, respectively. (B) Western blotting of purified ChtBD-bFGFand bFGF. Purified ChtBD-bFGF and bFGF proteins were analyzed by westernblotting with mouse anti-bFGF and HRP-labeled rabbit anti mouse IgG antibody.

ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)的結(jié)合機(jī)制。為了揭示ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)結(jié)合的機(jī)制，我們通過(guò)HoDock1對(duì)接方法預(yù)測(cè)ChtBD、bFGF和N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）之間相互作用形成的復(fù)合物，該方法包括初始剛性對(duì)接和精細(xì)半柔性對(duì)接。由北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院王存新研究組開(kāi)發(fā)的對(duì)接程序 HoDock 包括從結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè), 初步對(duì)接, 到對(duì)接后的精修聚類,打分篩選的各個(gè)步驟［2］。這里的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對(duì)接即是從自由狀態(tài)的兩個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)出發(fā), 預(yù)測(cè)這兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合后的復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型。我們生成了9600個(gè)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，以確定最終正確的復(fù)雜結(jié)構(gòu)模型（Gong等人，2010年；Pronk等人，2013年）。甲殼素是一種高分子碳水化合物分子，由長(zhǎng)鏈的NAG單元通過(guò)糖苷鍵連接在一起。因此，ChtBD、bFGF和NAG之間的相互作用可以揭示ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)結(jié)合的機(jī)制。

圖2顯示復(fù)合物是由ChtBD、bFGF和NAG鏈之間的相互作用形成的。顯示了4?內(nèi)原子周圍的NAG。ChtBD-bFGF的NAG結(jié)合位點(diǎn)由6個(gè)氨基酸殘基組成。含有NAG結(jié)合位點(diǎn)的5個(gè)氨基酸殘基屬于ChtBD。只有一個(gè)氨基酸殘基來(lái)自bFGF。ChtBD與NAG的結(jié)合對(duì)bFGF的結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有干擾。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ChtBD-bFGF的幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)主要位于ChtBD，而ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)的結(jié)合并不影響bFGF的生物活性。

ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)膜結(jié)合力和生物活性。我們通過(guò)ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)膜結(jié)合試驗(yàn)，驗(yàn)證了其結(jié)合力和生物活性。以單克隆抗bFGF抗體和二級(jí)Alexa-Fluor 488標(biāo)記的抗鼠IgG抗體，采用免疫熒光法檢測(cè)ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)膜的結(jié)合能力。將甲殼素膜分別浸泡在ChtBD-bFGF和bFGF濃度為500μg/ml的溶液中，4°C浸泡12h，以PBS浸泡相同條件的甲殼素膜為對(duì)照。用PBS 3×5min洗滌甲殼素膜，用兔抗鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體（1∶2000稀釋液）在室溫下孵育2h。用PBS洗滌3×5 min后，將殼聚糖膜與二級(jí)Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:2000稀釋液）在室溫黑暗中孵育2 h，用熒光成像儀（CRI Maestro）采集ChtBD-bFGF和bFGF結(jié)合活性的光學(xué)數(shù)據(jù)。圖4（B）顯示ChtBD-bFGF@chitin膠片高于bFGF@chitin膜和甲殼素膜。結(jié)果表明，殼聚糖膜表面ChtBD-bFGF的含量高于bFGF。ChtBD-bFGF的平均信號(hào)強(qiáng)度是bFGF的3.02倍。

同時(shí)，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)驗(yàn)證加入ChtBD結(jié)構(gòu)域后對(duì)bFGF活性的影響。BALB/C 3T3細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)中心。BALB/C 3T3細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS；Gibco）、100單位/ml青霉素（Sigma）和100 mg/ml鏈霉素（Sigma）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)和擴(kuò)增。細(xì)胞以1.2×10⁴/孔接種于96孔板（Costar）中。培養(yǎng)24 h后，除ChtBD bFGF和bFGF外，用含2%FBS的DMEM替換培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物加入1 mg/ml甲基噻唑四唑鹽（MTT）中，在37℃下培養(yǎng)4 h，去除培養(yǎng)基后加入400μl二甲基亞砜。立即測(cè)定492 nm處的吸光度。圖4（A）所示為鐘形曲線，在10–35 pM時(shí)活性最大。ChtBD bFGF和bFGF在適當(dāng)濃度下促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，在高濃度（>100 pM）下抑制成纖維細(xì)胞增殖。ChtBD-bFGF活性曲線與bFGF活性曲線相似。結(jié)論ChBD不影響ChtBD-bFGF的活性。

Fig. 4.(A) Biological activity of bFGF and ChtBD-bFGF tested by stimulated BALB/C 3T3cell proliferation. (B) Chitin-binding ability

of bFGF and ChtBD-bFGF weredetected by immunofluorescence. (a, ChtBD-bFGF@chitin; b, bFGF@chitin; c,chitin film).   Error bars represent standard deviation for n = 3.

幾丁質(zhì)對(duì)ChtBD-bFGF和bFGF的攝取和釋放。將甲殼素膜浸入500μg/mlChtBD-bFGF和bFGF溶液中獲得ChtBD-bFGF@chitin薄膜，以及bFGF@chitin薄膜用于體外釋放研究。將含有ChtBD-bFGF和bFGF的幾丁質(zhì)膜（1 mm²）在37℃和60 rpm攪拌下在2.0 ml磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中培養(yǎng)。在指定的時(shí)間間隔內(nèi)，收集0.2 ml上清液。OD280測(cè)定蛋白質(zhì)含量。通過(guò)繪制釋放蛋白累積含量百分比隨時(shí)間的變化曲線，得到釋放曲線。實(shí)驗(yàn)分三次進(jìn)行。ChtBD-bFGF的吸附能力和bFGF與幾丁質(zhì)膜的結(jié)合如圖5A所示。由于ChtBD-bFGF含有ChtBD，因此吸收的ChtBD-FGF比bFGF多（11.4倍）。圖5B顯示了ChtBD-bFGF和bFGF從幾丁質(zhì)薄膜中的體外累積釋放行為。這些特征是釋放百分比隨時(shí)間的變化。不含ChtBD適配器的bFGF具有高爆發(fā)釋放（圖5B）；在最初的48小時(shí)內(nèi)釋放了約73%的負(fù)載bFGF。ChtBD-bFGF表現(xiàn)出持續(xù)釋放行為ChtBD-bFGF@chitin薄膜。具體來(lái)說(shuō)ChtBD-bFGF@chitin這種薄膜在48小時(shí)內(nèi)首次爆發(fā)性釋放7.6%，但隨后在7天內(nèi)釋放速度較慢。釋放動(dòng)力學(xué)表明，90%的ChtBD-bFGF在釋放7天后與幾丁質(zhì)膜緊密結(jié)合，這有助于生長(zhǎng)因子以非擴(kuò)散的方式與受體相互作用。在bFGF釋放動(dòng)力學(xué)中，7天后82%的bFGF釋放到孵育緩沖液中，這表明bFGF以擴(kuò)散的方式與受體相互作用。

Fig.5. The adsorption ability of ChtBD-bFGF and bFGF binding to the chitin film(A). Release kinetics of ChtBD-bFGF and bFGF from the chitin film (B). Errorbars represent standard deviation for n = 3.

皮下植入期間增強(qiáng)新生血管。將ChtBD-bFGF@chitin的甲殼質(zhì)薄膜植入皮下，評(píng)估血管化能力。新生血管化是重塑和組織再生中至關(guān)重要的階段（Wu，Chen，Scott，&Tredget，2007）。內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)記物CD31用于評(píng)估皮下植入部位的新生血管化。植入后第7天，免疫熒光染色顯示植入部位明顯新生血管ChtBD-bFGF@chitin電影，bFGF@chitin薄膜和甲殼質(zhì)薄膜（圖7）；在以下部位沒(méi)有明顯的新生血管thebFGF@chitin薄膜或甲殼質(zhì)薄膜。這表明ChtBD-bFGF@chitin膜的新生血管化能力高于bFGF@chitin電影。新生血管在傷口愈合過(guò)程中起著重要作用。理想的傷口敷料應(yīng)促進(jìn)血管生成。ChtBD-bFGF與幾丁質(zhì)膜的結(jié)合持續(xù)刺激細(xì)胞表面的受體。因此，有更多的新血管ChtBD-bFGF@chitin電影比其他群體。這ChtBD-bFGF@chitin薄膜是一種具有很強(qiáng)新生血管能力的傷口敷料。

Fig. 7. Histological analysis of vascularization induced byChtBD-bFGF@chitin films (A, D), bFGF@chitin films (B, E),   and chitin films (C,F). Panels A, B, C are the HE stain.The white arrowsindicate blood vessels. Panels D, E, F are CD31 immunofluorescence satin, andwhite arrows indicate endothelial (CD31) cell marker. Bar 200 μm.

bFGF對(duì)于傷口愈合至關(guān)重要，并且在肉芽組織形成、再上皮化和組織重塑中發(fā)揮作用（Power、McLeskey和Wellstein，2000）。而bFGF在慢性創(chuàng)面中的表達(dá)水平降低。臨床上使用bFGF治療傷口具有很大的治療潛力（Robson，1997）。bFGF在創(chuàng)面常有突發(fā)性釋放和低蓄積，需要長(zhǎng)時(shí)間、大劑量給藥才能維持治療效果。高濃度的bFGF將導(dǎo)致腫瘤血管生成和血管腫瘤（Giavazzi等人，2003年；Liekens等人，2001年）。因此，結(jié)合bFGF的設(shè)計(jì)和合成被用來(lái)克服這些缺點(diǎn)。我們選擇甲殼素膜是因?yàn)樗鼈冇欣诖龠M(jìn)皮膚快速再生和加速傷口愈合。幾丁質(zhì)已作為傷口愈合產(chǎn)品的一種成分制備成各種形式（Allen&Prudden，1966；Hoffmeister，Wenner，Wilkens和Mukhtar，1964；Prudden，Migel，Hanson，Friedrich和Balassa，1970；Yusof等人，2003）。

在這里，我們選擇幾丁質(zhì)作為模型，制備新型多糖結(jié)合性生長(zhǎng)因子。重組蛋白ChtBD-bFGF在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖方面具有與bFGF相同的生物學(xué)活性。ChtBD-bFGF體外幾丁質(zhì)結(jié)合能力是bFGF的11.4倍（最高286μg/cm2）。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，ChtBD-bFGF比bFGF更有效地通過(guò)幾丁質(zhì)（殼聚糖）膜敷料的擔(dān)載和植入，促進(jìn)移植部位的血管生成，加速創(chuàng)面愈合。

該文章發(fā)表于CarbohydratePolymers（2017），該項(xiàng)技術(shù)獲得中國(guó)發(fā)明專利授權(quán)（201510887465.8），并在團(tuán)隊(duì)的產(chǎn)業(yè)化公司實(shí)現(xiàn)落地轉(zhuǎn)化。未來(lái)我們將圍繞這種生長(zhǎng)因子獨(dú)特的幾丁質(zhì)/殼聚糖結(jié)合特性，開(kāi)發(fā)基于幾丁質(zhì)多糖材料的系列體外和體內(nèi)再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)品，包括細(xì)胞培養(yǎng)關(guān)鍵載體材料和急性慢性創(chuàng)面的創(chuàng)傷修復(fù)材料。

參考文獻(xiàn)：

1.   A chitin film containing basicfibroblastgrowth factor with a chitin-binding domain as wound dressings. CarbohydratePolymers,2017, 174:723-730。Yu Wang, Chuan Fu, ZhenxuWu,Li Chen,Xuesi Chen,Yen Wei,Peibiao Zhang*.

2.   X. Q. Gong, P. W. Wang, F.Yang, S. Chang, B. Liu, H. Q. He, L. B. Cao, X. J. Xu, C. H. Li*, W. Z. Chen,C. X. Wang*. Protein-protein docking with binding site patch prediction andnetwork-based terms enhanced combinatorial scoring. Proteins2010;78(15):3150-3155.

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